Sequenciamento de Nova Geração e Sanger: Conheça as diferenças 

Neste artigo, vamos explorar o que é NGS e como ele se compara ao método tradicional de Sanger, suas aplicações e diferentes tipos de tecnologia atualmente disponíveis.

O que é sequenciamento de nova geração?  

O Sequenciamento de Nova Geração ou Sequenciamento de Próxima Geração (do inglês Next Generation Sequencing, NGS) é o termo guarda-chuva aplicado a um conjunto de técnicas modernas que permite a obtenção das sequências de nucleotídeos em moléculas de DNA e RNA de diversos organismos, como seres humanos, fungos, animais, plantas e vírus.  

É possível obter as sequências de nucleotídeos de uma gama de diferentes amostras biológicas incluindo sangue, saliva, leite, tecidos provenientes de biópsias, raízes, folhas e outros.  

 

Como o NGS pode ser aplicado? 

Desde a identificação de mutações patogênicas em diversas sequências de seres humanos, à quantificação do impacto de uma combinação de variantes que resultam em características complexas, ou ainda o estudo da história adaptativa dos seres humanos, o NGS vem sendo aplicado para responder grandes e pequenas perguntas.  

No contexto médico, por exemplo no diagnóstico de doenças genéticas – como na identificação de doenças raras e na pesquisa em câncer – que muitas vezes tem aspectos hereditários e cuja caracterização mutacional é de fundamental importância. 

As aplicações no contexto médico são apenas algumas, mas diversas outras são possíveis quando se olha para o contexto da biodiversidade, como em estudos de microbioma – para a identificação de gêneros e espécies microbianas presentes em amostras de solo, água, fezes humanas e animais e outros; e na análise de evolução e ecologia – na compreensão de variabilidade em populações em diversas escalas geográficas e temporais.   

Aqui iremos explorar a base das tecnologias de sequenciamento e em postagens futuras você descobrirá ainda mais sobre essas aplicações. 

 

Sequenciamento de Sanger é NGS?  

Não, o volume de sequenciamento obtido através de NGS é bem maior, permitindo o sequenciamento de milhões de fragmentos simultaneamente enquanto, no método de Sanger, mesmo protocolos mais robustos geram pequenos volumes de dados.   

 

Sanger  

O sequenciamento de Sanger é uma técnica que permite determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNA. Nesse método, que se baseia em terminação de síntese da cadeia de nucleotídeos são utilizados: uma fita molde de DNA de interesse, uma enzima DNA polimerase, nucleotídeos convencionais e nucleotídeos modificados (di-deoxinucleotídeos). A DNA polimerase realiza seu trabalho incorporando nucleotídeos à fita molde, contudo, seu trabalho é impossibilitado depois da adição de um di-deoxinucleotídeo, impedindo o alongamento da fita recém-criada. Isso gera fragmentos de DNA de diferentes tamanhos produzidos a partir da fita molde original.   

No método clássico, eram necessárias quatro reações como as descritas acima, uma para cada nucleotídeo modificado e marcado radioativamente. Posteriormente, a marcação por fluorescência de cada tipo de nucleotídeo permitiu que esta etapa de alongamento e terminação de cadeia fosse realizada com apenas uma reação. Após a geração dos fragmentos, estes são então separados por uma eletroforese de acordo com seus tamanhos e então a sequência de nucleotídeos pode ser desvendada.  

  

NGS  

 Já o sequenciamento de nova geração (NGS)  lança mão de metodologias distintas à do método de Sanger, apesar de algumas tecnologias guardarem similaridades como na adição de nucleotídeos fluorescentes em uma fita molde crescente por uma DNA polimerase. No surgimento do sequenciamento NGS o foco era no desenvolvimento de protocolos que acelerassem a obtenção de dados e baixasse o custo do sequenciamento – mantendo ou melhorando a qualidade dos resultados obtidos. No sequenciamento de nova geração há o processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA o que permite gerar uma maior quantidade de dados com mais rapidez. O sequenciamento NGS traz melhor custo-benefício, maior resolução e sensitividade, além de maior capacidade de multiplexing (processamento de múltiplas amostras simultaneamente) com tecnologias de barcoding (etiquetamento, código de barras). 

Referências 

Goodwin, Sara, John D. McPherson, and W. Richard McCombie. “Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.” Nature reviews genetics 17.6 (2016): 333-351. 

Ashley, Euan A. “Towards precision medicine.” Nature Reviews Genetics 17.9 (2016): 507-522. 

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